ایمونوفلورسانس (IFA) چیست؟
ایمونوفلورسانس (IFA) یک تکنیک ایمونوشیمیایی مهم است که امکان تشخیص و بررسی طیف گسترده ای از آنتی ژن ها و آنتی بادی ها را در یک برش بافتی یا سلولی فراهم می کند.
همچنین می توان گفت ایمونوفلورسانس یک روش میکروسکوپی است که از میکروسکوپ فلورسنت برای شناسایی آنتی بادی ها در برابر مواد آنتی ژنی خاص استفاده میشود. علاوه بر این یک روش استاندارد ویروس شناسی برای شناسایی حضور آنتی بادی ها از طریق توانایی خاص آنها در واکنش با آنتی ژن های ویروسی بیان شده در سلول های آلوده می باشد و می تواند پروتئین های ویروسی بیان شده در سلول ها را از طریق واکنش آنتی ژن- آنتی بادی شناسایی کند. این تست اغلب برای تایید نتایج مثبت بدست آمده توسط ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) یا MFIA® (Multiplexed Fluorometric ImmunoAssay) استفاده می شود. معمولاً به عنوان یک آزمایش تأییدی استفاده می شود. زیرا مکان واکنش های آنتی بادی-آنتی ژن را می توان در یک سلول آلوده مشاهده کرد.
انواع ایمونوفلورسانس (IFA) چیست؟
بسته به دامنه آزمایش یا آنتی بادی های خاص مورد استفاده، دو روش در دسترس است:
روش مستقیم (اولیه) یا غیر مستقیم (ثانویه).
_ روش مستقیم (اولیه):
ایمونوفلورسانس مستقیم (DIF) تکنیکی است که در آزمایشگاه برای تشخیص بیماری های پوست، کلیه و سایر سیستم های اندام استفاده می شود. به آن تست فلورسنت مستقیم ایمنی یا ایمونوفلورسانس اولیه نیز می گویند. ایمونوفلورسانس اولیه یا مستقیم از یک آنتی بادی منفرد استفاده می کند که از نظر شیمیایی به یک فلوروفور مرتبط است. آنتی بادی مولکول هدف را می شناسد و به آن متصل می شود و فلوروفور حامل آن از طریق میکروسکوپ قابل تشخیص است.
این تکنیک نسبت به پروتکل ثانویه (یا غیرمستقیم) چندین مزیت دارد. زیرا به طور مستقیم آنتی بادی به فلوروفور (کروموفور) متصل است. این امر تعداد مراحل در فرآیند رنگ آمیزی را کاهش می دهد و فرآیند را سریع تر میکند. همچنین می تواند سیگنال پس زمینه را با اجتناب از برخی مشکلات مربوط به واکنش متقاطع یا عدم اختصاصی بودن آنتی بادی کاهش دهد. با این حال، از آنجایی که تعداد مولکول های فلورسنت که می توانند به آنتی بادی اولیه متصل شوند محدود است، ایمونوفلورسانس مستقیم حساسیت کمتری نسبت به ایمونوفلورسانس غیرمستقیم دارد.
_ روش غیر مستقیم (ثانویه):
ایمونوفلورسانس ثانویه یا غیرمستقیم از دو آنتی بادی استفاده می کند. آنتی بادی اولیه بدون برچسب به طور خاص به مولکول هدف متصل می شود و آنتی بادی ثانویه که حامل فلوروفور است، آنتی بادی اولیه را شناسایی میکند و به آن متصل می شود. آنتی بادی های ثانویه متعدد می توانند به یک آنتی بادی اولیه متصل شوند. همین باعث تقویت سیگنال با افزایش تعداد مولکول های فلوروفور در هر آنتی ژن می شود.
این پروتکل پیچیده تر و زمان برتر از پروتکل اولیه (یا مستقیم) است. اما انعطاف پذیری بیشتری را ممکن می‌سازد. زیرا انواع آنتی بادی های ثانویه مختلف و تکنیک های تشخیص را می توان برای یک آنتی بادی اولیه معین استفاده کرد. این روش به طور گسترده به عنوان یک سنجش تاییدی در تشخیص HIV استفاده می شود.
روش سنجش ایمونوفلورسانس (IFA) چیست؟:
اول از همه، سلول های مبتلا به ویروس که روی ورقه های شیشه ای استریل 12 میلی متری قرار گرفتند، رشد می کنند. برای فیکس آنتی ژن، سپس سلول ها توسط پارافورمالدئید ثابت می شوند تا پروتئین های موجود در سلول ها برای اتصال آنتی بادی آماده شوند. سلول ها توسط یک شوینده مناسب مانند تریتون X-100 نفوذ پذیر می شوند. یک آنتی بادی خاص (مثلاً سرم بیمار) روی سطح اعمال می شود تا آنتی ژن ویروسی توسط آنتی بادی شناسایی شود. آنتی بادی ثانویه که مختص قطعه Fc مولکول IgG آنتی بادی اولیه است اعمال می شود.
از آنجایی که یک رنگ فلورسانس به آنتی بادی ثانویه مرتبط است، آنتی ژن را می توان در زیر میکروسکوپ فلورسانس مشاهده کرد. همانندسازی درون سلولی آنتی ژن ویروسی را می توان با IFA آشکار کرد. علاوه بر این، دو یا حتی سه آنتی ژن را می توان به راحتی با استفاده از دو تا سه آنتی بادی مجزا به طور همزمان مشاهده کرد.
نتایج آزمایش به صورت مثبت، منفی یا مشکوک ارائه می شود.
در حال حاضر، IFA برای اهداف تحقیقاتی به جای اهداف تشخیصی استفاده می شود. با این وجود، در روزهای اولیه که کیت ELISA هنوز به صورت تجاری در دسترس نبود، IFA برای اهداف تشخیصی با استفاده از سرم بیماران به عنوان آنتی بادی اولیه مورد استفاده قرار گرفت.
کاربرد موثر این روش شامل چندین ملاحظه از جمله ماهیت آنتی ژن، ویژگی و حساسیت آنتی بادی اولیه، خواص برچسب فلورسنت، روش نفوذپذیری و تثبیت نمونه، و تصویربرداری فلورسانس از سلول است. اگر چه هر پروتکل بسته به نوع سلول، آنتی بادی و آنتی ژن نیاز به تنظیم دقیق دارد. تقریباً برای همه کاربردها مراحل مشترکی وجود دارد.
ایمونوفلورسانس را می توان بر روی سطوح بافتی، سلول های کشت شده یا سلول های فردی که با روش های مختلف ثابت می شوند، استفاده کرد. در این روش می توان از آنتی بادی ها برای تجزیه و تحلیل توزیع پروتئین ها، گلیکوپروتئین ها و سایر اهداف آنتی ژنی از جمله مولکول های کوچک بیولوژیکی و غیر بیولوژیکی استفاده کرد.
میکروسکوپ فلورسنت:
برای تجزیه و تحلیل نمونه های ایمونوفلورسانس می توان از میکروسکوپ IF که در چندین طرح وجود دارد، استفاده کرد. ساده ترین میکروسکوپ، اپی فلورسانس است. در حالی که میکروسکوپ کانفوکال به طور گسترده ای مورد استفاده قرار می گیرد، طرح های جدیدتر میکروسکوپ های با وضوح فوق العاده، مانند میکروسکوپ STED (تخلیه انتشار تحریک پذیر) و موارد دیگر، امکان نانوسکوپی را فراهم می کنند و قادر به وضوح بسیار بالاتر هستند.
مزایای ایمونوفلورسانس (IFA) چیست؟
انجام این روش کم هزینه می باشد. همچنین در این روش مورفولوژی و محل فلورسانس را می توان برای افتراق واکنش های خاص از غیر اختصاصی ارزیابی کرد.
معایب ایمونوفلورسانس
به دلیل محدودیت های کارایی، IFA یک ابزار غربالگری سرولوژیک اولیه نیست. در این روش میکروسکوپ فلورسنت مورد نیاز است. تفسیر ذهنی می باشند و نتایج کمی نیستند و محدود به یک آنتی ژن در هر اسلاید می باشد. فلورسانس غیر اختصاصی رایج است و شدت فلورسانس متغیر است. مانند تمام تست های سرولوژیک، IFA ارگانیسم عفونی را تشخیص نمی دهد. فقط یک نشانه از عفونت قدیمی را نشان می دهد. از آنجایی که حیوانات آنتی بادی تولید نمی کنند، IFA برای استفاده در حیوانات دارای نقص ایمنی مناسب نمی باشد.
مطالب مشابه:
آزمایش آلفافتوپروتئین (AFP)
تست BCR-ABL
منابع: ncbi.nlm.nih ، criver ، sciencedirect ، pubmed ، svarlifescience ، rockland ، dermnetnz
