علل جواب های غیرمعمول (NIPT)
بررسی سیستماتیک علل جواب های غیرمعمول (NIPT) در موارد آنیوپلوئیدی
آزمایش های غیر تهاجمی قبل از تولد (NIPT) در سراسر جهان برای تشخیص آنیوپلوئیدی های کروموزومی رایج انجام می شود. NIPT برای سندرم داون، با استفاده از (cfDNA) در خون مادر، در سطح بالینی در ایالات متحده در اکتبر 2011 در دسترس قرار گرفت. این آزمایش برای تشخیص تریزومی های اصلی جنین (تریزومی 21 ،18و13) بسیار دقیق است. نتایج NIPT اغلب در جنین در صورت داشتن آنئوپلوئیدی (ناهنجاری عددی) کروموزوم های خاص، مثبت است. با این حال،NIPT به دلیل نتایج نادر مثبت کاذب و منفی کاذب، همچنان یک تست غربالگری محسوب می شود. از آنجایی که NIPT یک تست غیر تشخیصی است. نتایج مثبت آزمایش باید توسط یک تست تشخیصی قطعی مانند نمونه برداری از پرزهای کوریونی (CVS) یا آمنیوسنتز تایید شود.
در ژاپن، ارزش پیش بینی کننده مثبت (positive predictive value)” NIPT برای تریزومی 21 (96.5) درصد، برای تریزومی 18(82.8) درصد، برای تریزومی 13 (63.6) درصد و در کل (89.4) درصد است.
اصل علل جواب های غیرمعمول (NIPT)
نتایج مثبت کاذب در محدوده مورد انتظار است. با این حال، علاوه بر نتایج مثبت و منفی، گزارشهایی از نتایج no call یا «غیرقابل گزارش» نیز وجود دارد. منظور از No call زمانی است که نتایج را به دلیل عوامل مختلفی مانند غلظت کم DNA کل یا جنین، تغییرات گسترده در ژنوم مادر، و تعداد ناکافی قطعات توالی شده نمیتوان گزارش کرد. فراوانی وقوع نتایج “غیر قابل گزارش” کم است. با این حال، حتی زمانی که این احتمال در طول مشاوره ژنتیک قبل از آزمایش توضیح داده شود، برای مادران باردار یک نتیجه غیر منتظره است. در چنین مواردی، مراحل احتمالی بعدی باید روشن شود.
NIPT دارای ارزش پیش بینی کننده منفی (Negative predictive value) 99.99 درصد یا بالاتر است.
دو مورد از 13481 مورد در ژاپن (حدود 0.01٪) نتیجه “منفی کاذب” را نشان دادند که در آن نوزادان با وجود منفی شدن نتیجه آزمایش، دارای ناهنجاری های کروموزومی بودند. موارد منفی کاذب بسیار کمتر از نتیجه غیر قابل گزارش است. عموماً در بدو تولد، چندین ماه پس از انجام آزمایش NIPT نمایان می شوند. چنین مواردی از نظر فراوانی برای زنان باردار نتایج غیر منتظره ای هستند. افزایش داده های NIPT همچنین محققان را قادر ساخته است تا تعیین کنند که آیا منفی کاذب تصادفی رخ می دهد یا اینکه علت زمینه ای وجود دارد. هنگامی که NIPT توسعه یافت و به طور بالینی مورد استفاده قرار گرفت، تشخیص داده شد که نتایج غیر قابل گزارش و منفی کاذب، هرچند در به میزان بسیار پایین، ولی رخ داده است. اما با وجود کم بودن این نوع نتایج برای زنان باردار غیر منتظره است.
NIPT در سال 2011 به صورت بالینی در دسترس قرار گرفت و یک آزمایش غربالگری بسیار دقیق است. بنابراین، شناسایی نتایج غیر معمول و علل آنها مهم است. در این مقاله، نتایج غیر منتظره NIPT شرح داده خواهد شد.
میزان و علل جواب های غیرمعمول (NIPT)
هنگامی که NIPT برای اولین بار انجام شد، نتایج غیرقابل گزارش تقریباً 1.9٪ در اولین خونگیری و حدود 1.3٪ پس از خونگیری دوم بود. اگر چه این اعداد بسته به گزارش متفاوت است، تصور میشود که فراوانی این نوع از جواب در محدوده 0.32-5.4٪ باشد. نرخ نتایج غیر قابل گزارش در یک مطالعه مشترک بین المللی 0.9٪ بود. با این حال، این میزان تقریباً 0.3٪ در خونگیری اولیه و تقریباً 0.1٪ برای آزمایش های تکراری انجام شده توسط پنج شرکت (Sequenom؛ Illumina؛ Ariosa Diagnostics؛ Labcorp؛ و Natera) در ژاپن بود.
این تفاوت را میتوان به نرخ پایین تر چاقی در زنان ژاپنی در مقایسه با نرخ جهانی چاقی در زنان نسبت داد. در حالی که غلظت DNA جنین به سن زنان باردار یا زمان معاینه مربوط نمی شود، غلظ DNA با افزایش وزن و BMI مادر کاهش می یابد.
هنگامی که جنین تریزومی 13 یا 18 داشته باشد، غلظت DNA جنین کاهش می یابد. شواهدی وجود دارد که نشان میدهد غلظت DNA جنین در موارد تریزومی 21 افزایش می یابد. اما مشخص نیست که آیا این غلظت با غلظت کاریوتایپ نرمال تفاوت دارد یا خیر. اندازه جفت کوچکتر و تاخیر رشد داخل رحمی جنین در موارد تریزومی 13 و 18 ممکن است در کاهش فتال فرکشن نقش داشته باشد. فتال فرکشن بالاتر آشکار جنین در نمونه های مثبت تریزومی 21 ممکن است یکی از دلایلی باشد که ارزش پیش بینی کننده مثبت تریزومی 21 بیشتر از تریزومی 13 یا 18 است.
شایع ترین دلایل برای نتایج غیرقابل گزارش
شایع ترین دلایل برای نتایج غیرقابل گزارش عبارتند از: مقدار مطلق ناکافی DNA کل و/ یا میزان DNA جنین نسبت به جفت، کسر جنینی (FF) زیر سطح قابل قبول (به عنوان مثال،<4٪)، و تعداد ناکافی قطعات توالی یابی شده. بسته به روش شناسی، فتال فرکشن پایین جنین ممکن است تا 50 درصد از تمام ناهنجاری ها را ایجاد کند.
وزن مادر:
نتایج یک گزارش جدید نشان می دهد که نتیجه این آزمایش به شدت به وزن مادر و فتال فرکشن (FF) در زمان نمونه گیری اولیه خون بستگی دارد. به طور کلی، 22 مورد از 110 مورد (19.6٪) در ژاپن با نتایج غیرقابل گزارش اولیه، فتال فرکشن پایین (<4٪) داشتند. از 94 موردی که مجددا مورد آزمایش قرار گرفتند. 61 مورد (9/64 درصد) نتایج مثبت یا منفی داشتند. اگر نتایج به دلیل غلظت DNA کم جنین غیر قابل گزارش باشد، ممکن است آزمایش تکرار شود. با این حال، هنگامی که زمان محدود است انجام یک آزمایش تهاجمی ممکن است بهتر باشد.
بیماری های خود ایمنی:
بیماری خود ایمنی نیز می تواند بر نتیجه NIPT تأثیر بگذارد. چندین مورد از نتایج غیرقابل گزارش مکرر در زنان باردار مبتلا به پورپورای ترومبوسیتوپنیک خودایمنی (ITP) گزارش شده است. کسر cfDNA پایین جنین ممکن است در زنان باردار مبتلا به بیماری خود ایمنی رخ دهد. زیرا واکنش های التهابی می تواند cfDNA مادر را در خون مادر افزایش دهد. نسبت cfDNA مشتق شده از جنین با افزایش cfDNA مشتق شده از سلول های مادر کاهش می یابد.
علاوه بر این، متیلاسیون غیرطبیعی DNA در سلولهای T بیماران لوپوس اریتماتوز سیستمیک (SLE) مشاهده میشود. که – همراه با آپوپتوز سلولهای T – میتواند منجر به افزایش cfDNA هیپومتیله در خون شود. طول قطعات DNA نیز بسیار کوتاه است. در نتیجه، در تحلیل های NIPT با استفاده از توالی یابی نسل جدید، الگوی متفاوتی در بیماران SLE نسبت به بیماران سالم مشاهده میشود.
مصرف هپارین در زمان بارداری:
مصرف هپارین نیز با نتایج آزمایش NIPT مرتبط است. هپارین، که برای جلوگیری از سقط جنین در سندرم آنتی بادی آنتی فسفولیپید و غیره استفاده می شود، می تواند بر تفسیر آزمایش NIPT تأثیر بگذارد. اندازه قطعه cfDNA جنین در بیماران مصرف هپارین کمی کمتر از افراد سالم است. قطعه cfDNA جنین با محتوای GC بالا نیز در خون و در نتیجه در آنالیز NIPT افزایش می یابد. که میتواند بر شمارش تعداد توالی ها تأثیر بگذارد.
هپارین برای القای آپوپتوز به لکوسیت های خون مادر متصل می شود و تصور میشود که عامل افزایش قطعات cfDNA مادر در خون باشد. از آنجایی که هپارین نیمه عمر کوتاهی دارد، جمع آوری خون زمانی که غلظت هپارین پایین است می تواند اثرات را به حداقل برساند. اگر در زمان اولین خونگیری از هپارین استفاده شود، می توان مصرف هپارین را در زمان آزمایش مجدد قطع کرد.
ناپدید شدن دوقلو:
ناپدید شدن دوقلوها – سقط جنین یک قل یا چند قل – ممکن است با نتایج غیرقابل گزارش و مثبت کاذب نیز همراه باشد. علت سقط جنین در حدود نیمی از این موارد، ناهنجاری های کروموزومی در جنین است. این در مورد دوقلوهای زیگوماتیک، یک نوزاد دارای کاریوتیپ طبیعی است. همچنین در حالی که دیگری دارای ناهنجاری های کروموزومی است. در این حالت، این احتمال وجود دارد که جفت جنین سقط شده با ناهنجاری کروموزومی به طور کامل جذب نشود. و وجود DNA آن بر نتایج NIPT تأثیر بگذارد و منجر به نتایج غیرقابل گزارش یا مثبت کاذب شود.
اگر نتیجه NIPT به دلایل دیگر غیرقابل گزارش باشد، اصولاً بهتر است خونگیری دوباره انجام نشود. بلکه یک آزمایش تشخیصی انجام دهید. در آن صورت اگر با سونوگرافی احتمال ناهنجاری نشان داده شود، با استفاده از روش ریزآرایه (میکرو اری) به علاوه روش G-banding، دقت تشخیصی بیشتر می شود.
دلایل نتایج مثبت کاذب و منفی کاذب در علل جواب های غیرمعمول (NIPT)
در بیش از 10 درصد از زنان، نتایج cfDNA با کاریوتایپ یوپلوئید جنین ناسازگار است. دلایل متعددی وجود دارد که چرا نتیجه آزمایش تشخیصی روی آمنیوسیت ها یا خون جنین ممکن است با نتیجه آزمایش cfDNA مطابقت نداشته باشد. NIPT منعکس کننده توزیع گسترده تروفوبلاست های آپوپتوتیک در گردش خون مادر است.
در حالی که آنالیز سیتوژنتیک تروفوبلاست، سلول های موجود در یک بیوپسی مجزا به دست آمده در طی یک روش تهاجمی را منعکس می کند. تشخیص این نکته مهم است که نتیجه آزمایش cfDNA ممکن است از نظر تحلیلی درست باشد. (یعنی ژنوتیپ جفت را به درستی تعریف می کند.) در حالی که از نظر بالینی نادرست است. (یعنی ژنوتیپ جنین را به درستی تعریف نمی کند.)
دلایل نتایج مثبت کاذب cfDNA
موزائیسم محدود به جفت:
یکی از دلایل نتایج مثبت کاذب cfDNA (یعنی جنین سالم است. اما آزمایش cfDNA نشان دهنده یک ناهنجاری کروموزومی است) موزائیسم محدود به جفت (Confined Placental Mosaicism) است. از آنجایی که منبع اصلی cfDNA “جنین” در گردش خون مادر، سلول های جفت است. آزمایش cfDNA نتایج مربوط به جفت را ارائه می دهد که ممکن است با بافت جنین ناسازگار باشد.
در این موارد، آزمایش cfDNA از نظر تحلیلی درست اما از نظر بالینی نادرست است. به طور معمول، CPM در طول CVS مشاهده می شود و یک کاریوتیپ طبیعی و ناهنجاری های کروموزومی به شکل موزاییک تشخیص داده می شود و زمانی که آمنیوسنتز انجام می شود. کاریوتایپ طبیعی مشاهده می شود. تجربه به دست آمده از CVS نشان میدهد که این ممکن است در 1 تا 2 درصد از بارداریها رخ دهد. و در مونوزومی X و تریزومی 13 بیشتر از تریزومی 21 یا 18 رخ می دهد.
ناپدید شدن دوقلو:
گاهی اوقات DNA خارج سلولی مربوط به یکی از دوقولوهایی است که مرده است. به عنوان مثال، اگر دوقلوهای مرده آنئوپلوئید باشد، ناپدید شدن دوقلوها می تواند یک نتیجه مثبت کاذب ایجاد کند.
موزائیسم مادری:
اکثر روش های آزمایش cfDNA فرض می کنند که مادر دارای کاریوتایپ طبیعی است. اما این همیشه درست نیست. به عنوان مثال، با افزایش سن، نسبتی از زنان دارای درصد کمی از سلول ها هستند که کروموزوم های غیرطبیعی دارند. (موزاییسم مادری)، و این میتواند منجر به یک نتیجه مثبت کاذب cfDNA شود. موزائیسم مادر را میتوان با کاریوتایپ کردن لنفوسیت های خون محیطی تشخیص داد. مطالب آموزشی و مشاوره باید شامل احتمال شناسایی ناهنجاری کروموزومی در مادر باشد.
نتایج مثبت کاذب همچنین میتواند به صورت اتفاقی باشد و 1 یا 2 مورد در هر 1000 جنین یوپلوئید ممکن است نتیجه مثبت کاذب بر اساس شانس داشته باشد.
نتایج منفی کاذب cfDNA
موزائیسم محدود به جفت:
دلایل cfDNA منفی کاذب (جنین بیمار است. اما آزمایش cfDNA نشان دهنده عدم وجود ناهنجاری کروموزومی است) CPM است. منفی کاذب در اطلاعات ژاپنی بسیار نادر است و در حدود 0.01٪ گزارش شدند. در این موارد، جنین از نظر کروموزومی غیر طبیعی است. در مواردی سلول هایی با کاریوتیپ طبیعی فقط در بافت پرز وجود دارند و موزاییکی با سلول های کاریوتیپ غیرطبیعی تشکیل میدهند.
از آنجایی که نتایج NIPT با نسبت نسبی سلول های دارای کاریوتیپ طبیعی و غیرطبیعی درون پرزها تعیین میشود. نسبت بالایی از سلول های با کاریوتیپ نرمال در موزاییک درون پرزها منجر به نتیجه منفی می شود. از آنجایی که جنین از نظر کروموزومی غیر طبیعی است اما NIPT منفی است، آزمایش تشخیصی قطعی انجام نمی شود.
در این موارد، آزمایش cfDNA از نظر تحلیلی درستاما از نظر بالینی نادرست است. (یعنی خود جنین آنئوپلوئید است). این وضعیت می تواند برای تریزومی 13 و 18 رخ دهد اما برای تریزومی 21 اتفاق نمی افتد. هنگامی که یک ناهنجاری کروموزومی پس از تشکیل سلول تخم و در طول تقسیمات جنینی ایجاد شود، به یک ناهنجاری کروموزومی از نوع موزاییکی تبدیل می شود. الگوی موزاییک توسط عوامل مختلفی از جمله زمان و شانس تعیین می شود. چنین منفی کاذبی می تواند منجر به استرس قابل توجهی برای مادران باردار و خانواده آنها شود.
سایر دلایل در مورد علل جواب های غیرمعمول (NIPT):
مانند تمام تست های آزمایشگاهی، خطاهای فنی ممکن است منجر به نتایج آزمایش مثبت کاذب و یا منفی کاذب شود. علاوه بر این، اگر بافت پیوندی (مغز استخوان یا اندامها) از یک اهدا کننده مرد بدست آید، آزمایش cfDNA ممکن است به دلیل آزاد شدن cfDNA مرد از اندام های اهدا کننده به سیستم گردش خون مادر، جنین دختر را به اشتباه به عنوان پسر شناسایی کند.
نحوه ی تشکیل جنین نرمال و جنین دارای ناهنجاری:
در زمان لقاح، تخم های بارور با کروموزوم های طبیعی ممکن است در طی فرآیند تقسیم سلولی مکرر دچار ناهنجاری های کروموزومی شوند. اگر تمام سلول ها طبیعی باشند، جنین شکل A میگیرد. هنگامی که یک ناهنجاری کروموزومی بین مراحل دو یا چهار تقسیم سلولی تا مرحله مورولا رخ می دهد، جنین و جفت به موزاییک استاندارد (جنین B در تصویر) تبدیل می شوند.
جنین C تا مرحله مورولا طبیعی است. اما پس از تبدیل شدن به بلاستوسیست، اگر سلولهای تروفکتودرم (سلولهای رویانی اپیتلیومی) دچار ناهنجاری های کروموزومی شوند (یا حتی زمانی که ناهنجاری در مرحله مورولا رخ دهد)، سلول های دارای ناهنجاری کروموزومی در جفت یافت میشوند.
در نتیجه، جنین طبیعی است و فقط جفت موزاییک است. که موزاییک جفت موضعی (همچنین یک نتیجه مثبت کاذب NIPT) از الگوی یافت شده در معاینه کوریون است. اگر همه سلول های دارای ناهنجاری های کروموزومی در جفت توزیع شوند. حتی اگر ناهنجاری ها در مرحله مورولا (جنین D) رخ دهند. ممکن است همه سلول های جفت ناهنجاری های کروموزومی داشته باشند و همه سلول های جنینی طبیعی باشند (NIPT مثبت کاذب). اگر توده سلولی داخلی موزائیک باشد و تروفکتودرم در مرحله بلاستوسیست طبیعی باشد (مانند جنین E)، ناهنجاری های کروموزومی نوع موزاییکی فقط در جنین رخ می دهد و منفی کاذب NIPT رخ می دهد.
مورولا از بلاستوسیت متمایز است. چرا که مورولا (۳–۴ روز پس از لقاح) به صورت توده ای شامل ۱۶ سلول همتوان بوده که شکل کروی دارند. در حالی که بلاستوسیست (۴–۵ روز پس از لقاح)، درون زونا پلوسیدا و در طول توده سلولی داخلی دارای حفره است.
اطلاعات اتفاقی در مورد علل جواب های غیرمعمول (NIPT)
تومورهای بدخیم ممکن است ناهنجاری های کروموزومی داشته باشند. بنابراین، اگر یک زن باردار تومور بدخیم داشته باشد، نتیجه NIPT ممکن است مثبت کاذب یا غیرقابل گزارش باشد. نئوپلازی بدخیم در زنان باردار نسبتا نادر است. اما تقریباً در 1 مورد از هر 1000 مورد رخ می دهد و مسئول حدود 15 درصد از نتایج مثبت کاذب NIPT است. 10 مورد سرطان در مادران از یک گروه با 125426 نتیجه NIPT، شناسایی شد. 7 مورد سرطان از 39 زن باردار که برای آزمایش آنوپلوئیدی چندگانه مثبت بودند، مشاهده شد.
گزارش دادند که 38 مورد از 55 مورد غیرقابل گزارش NIPT پروفایل ژنومی تغییر پیدا کرده است. که 18 مورد دارای بدخیمی و 20 مورد دارای فیبروم رحمی خوش خیم بودند. یک بررسی جدید نشان می دهد که سرطان نورواندوکرین، آنژیوسارکوم و کارسینوم سلول کوچک نیز می توانند نتایج مثبت کاذب ایجاد کنند. با این که، فراوانی حدود 1 در 10000 درNIPT است اما قابل چشم پوشی نسیت.
آزمایش آمنیوسنتز در زنان باردار که نتیجه آزمایش NIPT مثبت داشته اند انجام می شود. اگر این نتیجه منفی باشد، باید در مورد ادغام تومورهای بدخیم احتیاط کرد.
اگرچه انواع زیادی از تومورهای بدخیم وجود دارد، اما در سرطان های خون مانند لوسمی و لنفوم به دلیل اینکه سلول های سرطانی در خون مادر هستند بروی NIPT اثر گذارند. انواع دیگری از سرطان مانند سرطان روده بزرگ نیز گزارش شدند. علاوه بر این مواردی که به دلیل فیبروم تومورهای خوش خیم و نه تومورهای بدخیم مثبت کاذب می شوند نیز گزارش شدند.
مناسب ترین روش انجام NIPT
در ژاپن، NIPT برای بررسی تریزومی های 21، 18 و 13 انجام می شود. اگر چه سایر ناهنجاری های کروموزومی بررسی نمی شوند، اما این ناهنجاری های طبقهبندی نشده ممکن است به طور تصادفی شناسایی شوند. زیرا بر مقادیر کمی کروموزوم های 21،18 و 13 تأثیر می گذارند. محبوب ترین روش برای انجام NIPT [massively parallel sequencing (MPS)] است که مقدار ژنوم مشتق شده از هر کروموزوم را تعیین می کند.
ناهنجاری های کروموزومی جنین را بر اساس میزان انحراف از محدوده استاندارد پیش بینی می کند. هنگامی که جنین دارای تریزومی 21 است. افزایش نسبت کروموزوم 21 در توده کل ژنوم ایجاد میشود. حتی اگر لزوماً آنئوپلوئیدی کروموزوم مورد بررسی نباشد. اگر مقدار ژنوم حاصل از یک کروموزوم افزایش یابد، مقدار ژنوم کروموزوم های دیگر به طور نسبی کاهش می یابد.
نتیجه گیری
زنان دارای حاملگی دوقلو، دوقلوهای ناپدید شده، نئوپلازی مادر، یا کسانی که در دوران بارداری تزریق هپارین داشتند. ممکن است نتیجه آزمایش NIPT آنها غیر قابل گزارش باشد و باید از این احتمال مطلع شوند و قبل از انجام تست NIPT تحت مشاوره ژنتیک قرار گیرند. توضیح منشا جفتی cfDNA به بیمار امکان می دهد، دید واضحی از توانایی ها و محدودیت های غربالگری قبل از تولد مبتنی بر cfDNA داشته باشد. اگر آزمایش های مبتنی بر cfDNA نشان دهنده تریزومی باشد، قبل از نتیجه گیری، آزمایش تائیدی لازم است. این بررسی نتایج غیر منتظره NIPT را توضیح می دهد و به بیمار دید واضحی از توانایی ها و محدودیت های غربالگری پیش از تولد مبتنی بر cfDNA ارائه می دهد.
بهینهسازی متد ممکن است با بهبود شناسایی ناهنجاری های با منشأ جفتی و مادری، امکان کاهش بیشتر در نتایج مثبت کاذب و منفی کاذب را در کنار مزایای دیگر این روش فراهم کند. NIPT عملکرد آنالایزرهای DNA را بهبود میبخشد. تمام آنوپلوئیدی های کروموزومی، ریزحذف های 7 مگابازی و یا بزرگتر، بیماری های تک ژنی ناشی از جهش یا وراثت اتوزومی غالب و برخی بیماری های ژنتیکی اتوزومی مغلوب را تشخیص می دهد.
مطالب مشابه:
