ژنتیک مولکولی

بخش مولکولی این آزمایشگاه با به کارگیری روش‌های مولکولی در تشخیص، درمان، کنترل، پیشگیری بیماری‌ های بدخیم خونی و غیر‌خونی، بیماری‌ های عفونی باکتریایی، ویروسی، قارچی، بیماری‌ های انعقادی و ترومبوفیلی فعالیت میکند.

اکنون روش‌ های متفاوتی جهت انجام آزمایش روی نمونه‌ های مختلف از قبیل خون، سرم، پلاسما، مایع نخاع، بلوک‌ های پاتولوژی با استفاده از متدهای PCR,PCR-RFLP, PCR-Sequencing, Real Time-PCR, PCR-Reverse dot blot, TMA و دستگاه‌های خودکار و پیشرفته با دارا بودن تاییدیه FDA در بخش مولکولی آزمایشگاه پاتوبیولوژی آرمین قابل انجام است.

ظهور چندین بیماری عفونی که می توانند به طور بالقوه بر سلامت عمومی در سراسر جهان تأثیر بگذارند. موضوعی است که در تحقیقات بالینی بسیار مورد توجه است. عوامل زیادی وجود دارد که بر ظهور بیماری های عفونی جدید تأثیر می گذارد.

برخی از این عوامل عبارتند از تنوع ژنتیکی در میزبان و عامل بیماری زا، تغییرات رفتاری جامعه، و همچنین فشارهای محیطی بر انسان و حیوانات. به این دلایل و سفر های بین المللی، امکان انتقال عوامل عفونی در جهان وجود دارد. به این دلیل، شناسایی پاتوژن های عامل بیماری، بخش مهم و ضروری در سلامت عموم مردم است. تکنیک های مولکولی باعث تکمیل روش های کشت سنتی و بر پایه آنتی ژن-آنتی بادی به منظور تشخیص، شناسایی و بررسی اپیدمیولوژیکی میکروارگانیسم های عفونی می شود.

یکی از روش های تشخیصی مولکولی مهم در آزمایشگاه ها، تکثیر ژن توسط PCR می باشد. PCR (واکنش زنجیره ای پلیمراز) یک روش سریع و مقرون به صرفه برای تکثیر و کپی قطعاتی از DNA می باشد. در تکنیک PCR برای تکثیر قطعه مورد نظر از تغییرات حرارتی استفاده می شود. برای انجام واکنش زنجیره ای پلی مراز از دستگاه Thermal cycler استفاده می شود.

PCR دارای مراحل دناتوراسیون (Denaturation)، مرحله (annealing) و مرحله پلیمریزاسیون (polymerization) می باشد.

در مرحله دناتوراسیون به مدت 30 تا 45 ثانیه در درجه حرارت به 92 تا 95 درجه سانتی گراد میرسد تا دو زنجیره DNA از هم باز شوند. همچنین در مرحله بعد برای اتصال پرایمر به DNA هدف دما در حدود ۵۵ تا ۶۵ درجه سانتی گراد می باشد.

در مرحله پایانی یا پلیمریزاسیون آنزیم DNA پلی مراز وارد عمل میشود و با استفاده از نوکلئوتیدهای تری فسفات از روی الگو DNA، قطعه جدید سنتز می شود. تکنیک PCR، کاربردهای متعددی دارد که می توان به تکثیر کپی های متعدد از ژن مورد مطالعه. بررسی حضور یا عدم حضور ژن مورد نظر، تشخیص بیماری های قبل از تولد، تعیین جنسیت جنین و تشخیص بیماری ها اشاره نمود.

برای شکل‌ گیری یک واکنش PCR و تکثیر ژن مورد نظر نیاز به مواد و اجزای متنوعی داریم تا تکثیر ژن به درستی انجام گرفته و مراحل انجام دادن آن بدون نقص و کامل باشد. علاوه بر رشته اصلی DNA به مواد دیگری از جمله آنزیم نیاز است. تا قطعات کوچک نوکلئیک اسید در کنار هم چیده و قطعات جدید را از روی رشته الگو بسازند.

اجزا مورد نیاز برای انجام واکنش PCR عبارتند از:

• الگوی DNA:

نمونه‌ای بوده که حاوی توالی DNA هدف است. در ابتدای واکنش، درجه حرارت بالا به مولکول DNA دو رشته‌ای اصلی اعمال میشود تا رشته‌ها از هم جدا شوند.

• آنزیم DNA پلیمراز:

نوعی آنزیم که رشته‌ های جدید DNA مکمل توالی هدف را سنتز می‌کند. اولین و متداول‌ ترین این آنزیم‌ ها استفاده از Taq DNA پلیمراز است. در حالیکه Pfu DNA پلیمراز به دلیل حساسیت بالاتر هنگام کپی کردن DNA، به طور گسترده‌ ای استفاده میشود. اگر چه این آنزیم‌ ها اندکی متفاوت بوده، اما هر دو دارای دو قابلیت هایی هستند که آنها را برای انواع PCR مناسب میکند. می‌ توانند با استفاده از الگو و پرایمرها رشته‌ های جدیدی از DNA تولید کنند و مورد بعدی مقاوم به حرارت هستند. در PCR Real-time رونویسی معکوس صورت میگیرد به این ترتیب که قبل از PCR با تبدیل RNA نمونه به cDNA توسط آنزیم «ترانس کریپتاز معکوس» (Reverse transcriptase) انجام میشود.

• پرایمرها:

پرایمرها یا آغازگرها قطعات کوتاه DNA تک رشته‌ ای مکمل توالی هدف هستند DNA پلیمراز به کمک این رشته‌ های کوتاه، سنتز رشته الگوی DNA را شروع میکند.

• واحدهای منفرد نوکلئوتیدها:

dNTP ها مانند بازهای C ،T ،A و G که اساساً واحدهای سازنده رشته‌ های DNA جدید هستند با کنار هم قرار گرفتن به صورت پشت سر هم، رشته‌ های جدید DNA را میسازند.

• یون منیزیم:

یون منیزیم (Mg⁺²) به عنوان یک فاکتور برای فعالیت DNA پلیمرازها با ایجاد اختلاط dNTP در حین پلیمریزاسیون عمل میکند. یون‌ های منیزیم در محل فعال آنزیم، تشکیل پیوند فسفودی استر را بین ′OH – 3 یک آغازگر و گروه فسفات یک dNTP کاتالیز می‌ کنند. علاوه بر این، Mg دو بار مثبت با ایجاد ثبات در بارهای منفی روی نردبان DNA فسفاته، ایجاد اتصال بین پرایمرها و الگوهای DNA را تسهیل می‌کند.

• بافر:

انواع PCR در بافرها انجام می‌ شوند که یک محیط شیمیایی مناسب برای فعالیت DNA پلیمراز را فراهم می‌ کنند. pH بافر معمولاً بین 8 تا 5/9 است و اغلب توسط Tris – HCl تثبیت میشود.

برخی از انواع PCR شامل:

PCR) Asymmetric PCR نامتقارن)

هدف از بكارگيری اين روش سنتز DNA تك رشته است. ترجیحا برای تکثیر یکی از رشته های مولکول DNA هدف با استفاده از غلظت نابرابر پرایمر به کاربرده می شود. در اين روش يكی از پرايمرها به تعداد كمتر و پرايمر ديگر به تعداد بيشتر با اختلاف 1:50 یا 1:100 به محيط واكنش اضافه می شود. در حدود 20 چرخه ابتدايی PCR محصول دو رشته به صورت فاز نمايی توليد می گردد. اما پس از 20 چرخه كه غلظت پرايمر كمتر در واكنش قابل چشم پوشی است و به عبارت عاميانه تر به دليل تمام شدن پرايمر با غلظت كمتر در چرخه های بعدی PCR فقط يك رشته از الگو به صورت خطی تكثير می شود. پس از پايان PCR چند نسخه DNA دو رشته ای و تعداد زيادی DNA تك رشته ای از ژن مورد نظر ايجاد خواهد شد.

ARMS PCR

روش Amplification Refractory Mutation System: اين روش تحت عنوان تكثير اختصاصی الل ها با PCR نيز ناميده می شود. اين روش برای تشخيص موتاسيون های نقطه ای به كار می رود و هدف از طراحی آن شناسایی الل های طبيعی و جهش يافته است. اساس اين روش تفاوت نوكلئوتيد انتهای 3َ پرايمرهای الل های مختلف است. دو واكنش PCR با استفاده از يك DNA الگو در 2 لوله جداگانه انجام می شود كه يكی از آنها حاوی پرايمرهای جهش يافته و ديگری حاوی پرايمر طبيعی می باشد. در هر واكنش پرايمر مشترك به همراه يكی از 2 پرايمر اختصاصی الل مورد استفاده قرار می گيرد.

حالت اختصاصی پرايمرها برای هر يك از الل ها ناشی از نوكلئوتيد انتهای 3َ آنهاست كه با هم متفاوت است. چنانچه پليمريزاسيون در لوله حاوی پرايمر طبيعی انجام شود نشان دهنده عدم جهش نقطه ای در باز مورد نظر است و اگر پليمريزاسيون در لوله حاوی پرايمر جهش يافته انجام شود نشان دهنده حضور جهش نقطه ای در باز مورد نظر است. نكته مهم اين است كه از DNA پليمرازی كه فاقد خاصيت تصحيح كنندگی اگزونوكلئازی َ5َ à 3َ است، استفاده شود. زيرا استفاده از يك آنزيم اصلاح گر باعث برداشتن باز جفت نشده انتهای 3َ می گردد و در واقع توانايی متمايز كردن دو الل از بين می رود. از اين روش در تشخيص موتاسيون های مولد مقاومت دارويی در باكتری ها استفاده می شود.

معرفی Real time PCR

در اين سيستم تشخيصی يك ماده فلورسانت در طی واكنش و متناسب با ميزان محصولات هر سيكل آزاد می شود. ميزان فلورسانت آن توسط دتكتور شناسايی و ثبت می گردد. بدين ترتيب ميزان DNA تكثيری طی يك چرخه تا چرخه بعدی را می توان اندازه گيری كرد. بنابراين ميزان محصول در هر چرخه قابل رديابی است در حاليكه محصول روش های سنتی پس از پايان واكنش و الكتروفورز مشخص می شود.

 Multiplex PCR یا PCR چندتایی

در اين تكنيك از چندين جفت پرايمر اختصاصی در يك محلول PCR جهت تكثير چندين توالی هدف در يك زمان استفاده می شود. بنابرين می توان با آزمايشات كمتر و زمان كوتاه تر اطلاعات بيشتری جمع آوری كرد.

Inverse PCR یا PCR معکوس

در اين روش هدف تكثير قطعه ای از DNA است كه هيچ اطلاعی در مورد توالی پايانه های آن در دست نيست. ولی در عوض توالی قسمتی از يك ناحيه درونی آن در دست است. برای اين هدف DNA ژنومی با يك آنزيم محدودالاثر مناسب هضم می شود. پس از اتصال مجدد مولكول ها، برای تشکیل قطعات DNA حلقوی، ناحیه مورد شناسایی با يك آنزيم محدودالاثر ديگر هضم می شود. اين امر باعث میشود نواحی ناشناخته بين 2 ناحيه شناخته شده حاصل از هضم آنزيمی قرار بگیرد. حال با طراحی پرايمر مناسب برای توالی شناخته شده می توان نواحی ناشناخته را تكثير كرد. اين روش برای شناسايی جايگاه های الحاق ويروسها و ترانسپوزون هايی كه بطور تصادفی در ژنوم ادغام می شود مفيد است.