ترتیب DNA و انواع آن
DNA (دئوکسی ریبونوکلئیک اسید) مولکول حامل ساختارهای مورد نیاز برای رشد ارگانیسم ها، زندگی و تولید مثل است. این ساختارها درون همه سلول ها وجود دارند و از والدین به فرزندان به ارث می رسند. DNA از مولکول هایی به نام نوکلئوتید و باز نیتروژنی تشکیل شدند. این 4 نوع باز نیتروژنی شامل: آدنین(A)، تیمین(T)، گوانین(G)، سیتوزین(C) هستند. در واقع ترتیب این بازها مشخص کننده ساختارهای DNA یا کدهای ژنتیکی می باشند.
توالی یابی DNA چیست؟
این تکنیک آزمایشگاهی برای مشخص نمودن ترتیب 4 نوع بلوک سازنده شیمیایی یا همان بازها که اطلاعات زیستی فرد را به اصطلاح کدگذاری می کنند به کار می رود. تعیین توالی دانشمندان را از اطلاعات ژنتیکی موجود در یک بخش خاص از DNA آگاه می سازد.
انواع فناوری ترتیب DNA و تفاوت های آنها
از زمان آغاز توالی یابی در دهه 1970 میلادی، برخی از تکنیک ها از بین رفتند. تعداد کمی از آنها تا به الان باقی مانده و به متد منتخب بسیاری از محققین برای درک تنوع ژنتیکی بدل گشتند.
- توالی یابی سنگر (Sanger sequencing)
- الکتروفورز مویرگی و آنالیز قطعه (Capillary electrophoresis and fragment analysis)
- توالی یابی نسل بعد (NGS)
توالی یابی سنگر
محققان برای توالی یابی های هدفمند، با خوانش کوتاه و ظرفیت کم به سراغ این روش می روند. با توجه به حساسیت و سادگی نسبی این روش از نظر گردش کار و تکنیک، امروزه توالی یابی سنگر، استاندارد طلایی در فناوری توالی یابی را داراست. در انواع توالی یابی، از نوع هدفمند تا تایید واریانت های قابل شناسایی در متدهای متعامد استفاده می شود.
توالی یابی سنگر برای شناسایی هویت و ترتیب بازهای نوکلئوتیدی در یک رشته معین DNA، از یک روش خاتمه زنجیره ای استفاده می کند. در این روش می بایستی از آنالوگ های شیمیایی این 4 باز استفاده گردد. این آنالوگ ها که ddNTPs نام دارند، فاقد گروه هیدروکسل مورد نیاز برای گسترش زنجیره های پلی نوکلئوتیدی تشکیل دهنده DNA هستند. با مخلوط شدن ddNTPs های نشان دار رادیویی با DNA الگو، هنگام ترکیب تصادفی، رشته هایی که با هر طول ممکن تولید شدند، به زنجیره خاتمه می دهند.
الکتروفورز مویرگی
در اواسط دهه 1990 میلادی، محققان با استفاده از الکتروفورز مویرگی، توالی یابی سنگر انجام دادند. در این فناوری، قطعات DNA نشان دار، بر اساس میزان طول، نازکی و فیبرآکریلیک پر شده از ژل ماتریکس از هم جدا می شوند.
نمونه ای حاوی قطعات نشان دار به داخل مویرگ تزریق میشود و یک میدان الکتریکی برای کشیدن قطعات به سمت بالا اعمال می شود. زمانی که لیزر تشخیص دهنده از درون ابزار عبور میکند، نشان ها (لیبل ها) مشخص میشود و توالی تعیین می گردد.
توالی یابی با توان بالا
تعیین توالی سنگر برای قطعات طولانی DNA به خصوص در حجم های کم، مفید و مناسب است. با این حال، در صورت نیاز به توالی یابی سریع تعداد زیادی مولکول، می تواند پرهزینه و پر زحمت باشد. اما روش هایی باکارآیی بالاتر و به شکل گسترده ای؛ به ویژه زمانی که به توالی یابی کل ژنوم ها نیاز است، مورد استفاده قرار گرفتند. در این روش در مقایسه با روش سنگر، سه تغییر بزرگ وجود دارد. ابتدا، رشد یک سیستم بدون سلول برای شبیه سازی قطعات DNA.
در شیوه سنتی، ابتدا قسمت مورد نیاز DNA برای توالی یابی را به یک پروکاریوت شبیه سازی میکردند و سپس قبل از استخراج و خالص سازی در داخل باکتری تکثیر می شدند. اما توالی یابی با توان بالا (High throughput Sequencing یا HTS) یا فناوری های توالی یابی نسل بعد (NGS یا Next generation Sequencing) دیگر به این روش کار متراکم و زمانبر، متکی نبودند. ثانیا، این روش ها فضایی را در جهت اجرای میلیون ها توالی یابی به صورت همزمان ایجاد کردند. این یک گام بزرگ رو به جلو نسبت به روش های اولیه بود.
توالی یابی DNA در چه مواردی کاربرد دارد؟
روش سنگر هم اکنون برای توالی یابی اولیه یک مولکول DNA در جهت دسترسی به اطلاعات توالی اولیه یک ارگانیسم یا ژن استفاده می شود. خوانش های نسبتا کوتاه حاصل از واکنش HTS ترسیم کل ژنوم یک ارگانیسم را دشوارتر می کند. گاهی توالی سنجی سنگر برای تایید نتایج HTS نیاز است. از سوی دیگر، HTS امکان استفاده از توالی یابی در جهت درک پلی مورفیسم های تک نوکلئوتیدی در میان شایع ترین تنوع های ژنتیک در یک جمعیت را فراهم می سازد.
اهمیت بالینی
این موضوع در زمینه زیست شناسی تکاملی و همچنین تشخیص ژن های تغییر پذیر عامل بیماری حائز اهمیت است. به طور مثال: تغییرات توالی مربوط به نمونه آدنوکارسینومای ریه می تواند باعث تشخیص جهش های نادر مرتبط با بیماری شود. شناسایی دقیق جایگاه های اتصال کروماتین برای پروتئین های هسته ای ویژه نیز با استفاده از این روش ها ممکن است. به طور کلی توالی یابی DNA در حال تبدیل شدن به بخش جدایی ناپذیر بسیاری از کاربردهای مختلف است.
کاربرد در زمینه تشخیص
توالی یابی ژنوم به شکل ویژه ای در تشخیص علت موارد نادر اختلالات ژنتیکی کاربرد دارد. در حالی که بیش از 7800 بیماری با الگوی وراثت مندلی در ارتباط هستند، کمتر از 4000 مورد از این اختلالات به طور قطعی با ژن و یا جهش خاصی ارتباط دارند. تجزیه و تحلیل های اولیه اگزون-ژنوم و یا اگزوم، که شامل تمامی ژن های بیان شده در یک ارگانیسم هستند، از وجود علت آللی (ژنتیکی) در بسیاری از بیماری های ارثی خبر میدهد.
در یک مورد ویژه، توالی یابی ژنوم در کودک مبتلا به بیماری التهابی روده (IBD) که از نوع شدید رنج می برد، منجر به کشف ارتباط این بیماری با ژن التهابی XIAP شد. در حالی که بیمار در ابتدا علائم متعددی که نشان دهنده نقص ایمنی بود از خود نشان داد. بر اساس نتایج توالی یابی DNA پیوند مغز استخوان توصیه شد و پس از آن کودک از این بیماری بهبود یافت.
علاوه بر این، HTS نقش مهمی در ایجاد درک بیشتر از تومورها و سرطان ها دارد. درک اساسی یک تومور و یا سرطان به پزشک در امر تشخیص یاری می رساند. اطلس ژنوم سرطان و همچنین کنسرسیوم بین المللی سرطان تعداد زیادی از تومورها را توالی یابی میکند و نشان دادند که این تومورها می توانند از لحاظ جهش بسیار متفاوت باشند. این منجر به آگاهی بهتر نسبت به گزینه های درمانی ایده آل هر بیمار می گردد.
مطالب مشابه:
